Résolution des problèmes de liaison des protéines marquées His aux colonnes Ni-NTA

Les protéines marquées par la polyhistidine (His) sont couramment utilisées dans l’expression et la purification des protéines recombinantes. Le marqueur His offre des avantages tels qu’une petite taille, une affinité élevée pour la liaison aux résines IMAC (Immobilized Metal Affinity Chromatography) et une purification en une étape. Cependant, il existe des cas où une protéine marquée His ne parvient pas à se lier à la colonne d’affinité de manière satisfaisante. Dans cet article, nous discutons des étapes de dépannage pour résoudre ce problème.

 

Défis courants et solutions

1. Optimisation du tampon de solubilisation

Problème :

Les résines Ni-NTA sont sensibles aux agents réducteurs (par exemple DTT) et aux agents chélateurs (par exemple EDTA ou EGTA). Ces substances peuvent affecter la capacité de liaison des résines IMAC.

Solution :

Assurez-vous que les tampons de solubilisation ne contiennent pas d’agents réducteurs ou chélateurs.

Maintenir une concentration d’imidazole à 15 – 25 mM dans le tampon de liaison pour empêcher la liaison protéique non spécifique.

Ajustez le pH du tampon près du point isoélectrique de la protéine.

2. Résine d’affinité fraîche et fonctionnelle

Problème : L’utilisation d’une résine Ni-NTA ancienne ou dégradée peut entraîner une mauvaise liaison.

Solution :

Utilisez toujours de la résine Ni-NTA fraîche, en particulier lorsque vous purifiez une nouvelle protéine pour la première fois.

Effectuez une liaison par lots avec une protéine témoin marquée His (préalablement purifiée à l’aide d’IMAC) aux côtés de votre protéine d’intérêt. Si la protéine témoin se lie, mais pas votre protéine, approfondissez vos recherches.

3. His-Tag masqué

Problème : Certaines protéines enfouissent le marqueur His dans leur structure native repliée, la rendant inaccessible à la coordination métallique.

Solution :

Test de liaison en présence d’agents dénaturants (par exemple, urée ou chlorure de guanidinium). Si la protéine de fusion marquée His se lie dans des conditions dénaturantes, le repliement caché des marqueurs peut être le problème.

Options :

Purifiez la protéine dans des conditions dénaturantes puis remettre des conditions non dénaturantes.

Ajoutez une liaison flexible (par exemple, poly-sérine ou poly-glycine) pour séparer le marqueur de la protéine de fusion.

Essayez de placer le tag His à l’extrémité opposée de la construction.

4. Tampon de liaison non optimal

Problème : La composition du tampon affecte la liaison au tag His.

Solution :

Faire attention à la concentration d’imidazole et au pH dans le tampon de liaison.

Optimisez les composants du tampon pour améliorer l’efficacité de la liaison.

Marqueurs alternatifs :

Marqueur Glutathione-S-Transferase (GST) : pour la purification et les dosages pull-down

Marqueur Biotine : pour l’immobilisation ou la détection

Marqueur Maltose-Binding Protein (MBP) : améliore la solubilité – pour la purification par affinité et les études d’interaction protéine-protéine

Strep-Tag® II : liaison de haute affinité à la streptavidine – pour les applications de purification et de détection

Marqueur FLAG™ (DYKDDDDK) : pour la détection, l’immunoprécipitation et le Western blot

Marqueur SUMO  : amovible – pour produire une protéine native en N-term

Marqueur Myc : amovible – pour la purification, la détection et la cristallisation

Marqueur Fc : Domaine constant IgG – pour la détection ELISA, la purification par affinité et l’augmentation de l’expression